REPRODUCIBLE BIOINFORMATICS

让 RNA-seq
从数据，到答案。

一套清晰、可追溯的转录组分析路径：质量控制、比对、定量与差异表达。每一步，都可以被复现。

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04: 核心阶段
03: 工具语言
100%: 可复现

transcript_015′ → 3′

GENE EXPRESSION12,483features

THE PIPELINE

四步完成标准分析

从 FASTQ 到生物学解释，每个阶段都有明确的输入、输出与质量指标。

质量控制

FastQC 检查碱基质量、接头污染与序列重复度。

*.fastq.gz → html

↦

序列比对

STAR 将高质量 reads 快速比对至参考基因组。

FASTQ → sorted BAM

表达定量

featureCounts 按注释文件生成基因表达矩阵。

BAM + GTF → counts

差异分析

DESeq2 建模、校正并筛选差异表达基因。

counts → DEG table

READY TO RUN

把方法写进代码

根据样本信息调整路径与分组，即可将下面的骨架用于常规双端测序数据。

# 1. QC and adapter trimming
fastqc raw/*.fastq.gz -o results/fastqc -t 8
fastp -i raw/sample_R1.fastq.gz -I raw/sample_R2.fastq.gz \
  -o clean/sample_R1.fq.gz -O clean/sample_R2.fq.gz \
  --html results/fastp/sample.html --thread 8

# 2. Alignment with STAR
STAR --runThreadN 16 --genomeDir reference/star_index \
  --readFilesIn clean/sample_R1.fq.gz clean/sample_R2.fq.gz \
  --readFilesCommand zcat --outSAMtype BAM SortedByCoordinate \
  --outFileNamePrefix results/star/sample.

# 3. Gene-level quantification
featureCounts -T 8 -p -a reference/genes.gtf \
  -o results/counts.txt results/star/*.bam

# Differential expression with DESeq2
library(DESeq2)

counts <- read.delim("results/counts_matrix.tsv", row.names = 1)
meta <- read.csv("metadata.csv", row.names = 1)

dds <- DESeqDataSetFromMatrix(
  countData = round(counts), colData = meta, design = ~ condition
)
dds <- dds[rowSums(counts(dds)) >= 10, ]
dds <- DESeq(dds)

res <- results(dds, contrast = c("condition", "treated", "control"))
deg <- subset(res, padj < 0.05 & abs(log2FoldChange) > 1)
write.csv(as.data.frame(deg), "results/DEG.csv")

# Quick QC summary of the DEG table
from pathlib import Path
import pandas as pd

result_dir = Path("results")
deg = pd.read_csv(result_dir / "DEG.csv", index_col=0)

summary = {
    "significant": int(deg["padj"].lt(0.05).sum()),
    "upregulated": int(deg["log2FoldChange"].gt(1).sum()),
    "downregulated": int(deg["log2FoldChange"].lt(-1).sum()),
}

print(pd.Series(summary, name="genes"))

BEFORE YOU RUN

结果可信，始于设计。

生物学重复

每组建议至少 3 个独立生物学重复；技术重复不能替代生物学重复。

记录批次因素

将批次、性别或组织来源写入 metadata，并在设计公式中控制混杂。

先看整体分布

在解释单个基因前，先检查 PCA、样本相关性和测序深度是否合理。

让 RNA-seq从数据，到答案。